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Aug 31, 2023

Nature Communications volumen 14, número de artículo: 3692 (2023) Citar este artículo

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La vigilancia en tiempo real del virus SARS-CoV-2 en el aire es una brecha tecnológica que ha eludido a la comunidad científica desde el comienzo de la pandemia de COVID-19. Las técnicas de muestreo de aire fuera de línea para la detección del SARS-CoV-2 adolecen de tiempos de respuesta más largos y requieren mano de obra calificada. Aquí, presentamos una prueba de concepto de monitor de calidad del aire (pAQ) de patógenos para la detección directa en tiempo real (resolución de 5 minutos) de aerosoles de SARS-CoV-2. El sistema integra sinérgicamente un muestreador de aire ciclónico húmedo de alto flujo (~1000 lpm) y un biosensor de microinmunoelectrodo ultrasensible basado en nanocuerpos. El ciclón húmedo mostró un rendimiento de muestreo de virus comparable o mejor que los muestreadores disponibles comercialmente. Los experimentos de laboratorio demuestran una sensibilidad del dispositivo del 77 al 83 % y un límite de detección de 7 a 35 copias de ARN viral/m3 de aire. Nuestro monitor pAQ es adecuado para la vigilancia en el punto de necesidad de variantes del SARS-CoV-2 en ambientes interiores y puede adaptarse para la detección multiplexada de otros patógenos respiratorios de interés. La adopción generalizada de dicha tecnología podría ayudar a los funcionarios de salud pública a implementar medidas rápidas de control de enfermedades.

La pandemia de la enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19), que comenzó en diciembre de 2019, todavía afecta a países de todo el mundo; la Organización Mundial de la Salud informó más de 1,7 millones de nuevos casos confirmados en todo el mundo durante la primera semana de enero de 20231. El síndrome respiratorio agudo severo coronavirus 2 (SARS) -CoV-2) el coronavirus causa esta enfermedad y se transmite a través de las gotitas respiratorias expulsadas por las personas infectadas al toser, estornudar, respirar y hablar. La transmisión aérea se reconoce como una de las vías de infección predominantes2,3, de ahí la rápida tasa de infectividad y la naturaleza virulenta de la enfermedad. Para combatir esta rápida propagación, los gobiernos de todo el mundo adoptaron políticas como el uso obligatorio de mascarillas en espacios públicos, la puesta en cuarentena de personas infectadas y el distanciamiento social para ayudar a reducir el riesgo de transmisión aérea. Sin embargo, esas medidas de control repercutieron negativamente en la vida cotidiana, con consecuencias como restricciones a los viajes aéreos, disminución de las actividades físicas, restricciones a las grandes reuniones sociales y cierre de escuelas y oficinas. Muchos países tardaron casi dos años en reanudar sus actividades normales. Sin embargo, el miedo a la infección y el rápido resurgimiento periódico de la enfermedad, por ejemplo, a finales de diciembre de 2022 en China4, ponen de relieve la falta de preparación incluso de las naciones más grandes para combatir la propagación de patógenos por vía aérea. La falta de disponibilidad de protocolos de detección de infecciones a nivel comunitario rápidos y asequibles ha sido un factor limitante para que los formuladores de políticas implementen estrategias rápidas de mitigación de la transmisión de COVID-19. Un dispositivo de vigilancia no invasivo en tiempo real que puede detectar aerosoles de SARS-CoV-2 directamente en el aire es una solución potencial para las estrategias de manejo de infecciones y la reanudación de las actividades normales.

Las técnicas de muestreo de aire fuera de línea se utilizan comúnmente para la detección de aerosoles de virus, donde la recolección y el análisis de muestras se realizan en dos etapas: primero, los aerosoles de virus se recolectan utilizando muestreadores de bioaerosoles independientes, después de lo cual las muestras se transportan a un laboratorio para su posterior análisis. Estudios recientes utilizaron técnicas de muestreo de aire fuera de línea, como muestras de líquido basadas en el crecimiento de partículas por condensación (PILS), PILS basadas en ciclones de pared húmeda y muestreo de filtros, seguido de la detección de virus mediante la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa con transcripción inversa (RT-qPCR). para detectar la presencia de ARN del SARS-CoV-2 en el aire del interior de hospitales5,6,7,8,9, centros comerciales10, transporte público10, habitaciones residenciales11 e incluso aire exterior12,13. Si bien estos hallazgos subrayan la importancia de un método de vigilancia para detectar virus transmitidos por el aire para controlar la propagación de la infección, estos métodos fuera de línea tienen un tiempo de respuesta prolongado (de 1 a 24 h), requieren mano de obra calificada y no brindan información en tiempo real, lo que Es necesario tomar medidas de control rápidas para gestionar la propagación aérea del virus.

Hasta donde sabemos, no existen dispositivos de detección de SARS-CoV-2 en el aire automatizados en tiempo real disponibles comercialmente. Esto se debe principalmente a dos lagunas tecnológicas: la primera es la necesidad de un muestreador de aerosoles de virus de alto flujo eficiente que pueda integrarse en un detector de virus en tiempo real. En segundo lugar está la necesidad de un protocolo de detección de virus que sea lo suficientemente rápido, preciso y sensible como para medir la baja concentración de virus que normalmente se encuentran en el aire ambiente. Estudios anteriores han demostrado que los muestreadores que funcionan a altos caudales pueden consolidar aerosoles de un gran volumen de aire y proporcionar una muestra concentrada para la caracterización biológica8,14,15. Por ejemplo, Ang et al.8 detectaron ARN del SARS-CoV-2 en el 72 % de las muestras recolectadas usando un muestreador de aire seco de 150 lpm en comparación con ningún virus detectado en muestras recolectadas usando el mismo muestreador operado a 50 lpm dentro de una sala de aislamiento de pacientes con COVID. . Atribuyeron la mayor detección de muestras a una mejor recuperación del virus a velocidades de flujo de muestreo más altas. Además, estudios recientes han demostrado la aplicación de PILS de alto flujo para recolectar directamente aerosoles cargados de patógenos en una solución líquida y cuantificarlos utilizando detectores de virus en tiempo real16 o técnicas fuera de línea8,14,17,18. Si bien ha habido avances significativos en el desarrollo de dispositivos PILS de alto flujo, muy pocos estudios integran el PILS con sensores en tiempo real para la detección de virus16.

Los biosensores han ganado popularidad recientemente como una alternativa asequible y prometedora a la RT-qPCR para detectar el SARS-CoV-2, ya que son de bajo costo, rápidos, sensibles y altamente específicos19,20. Los inmunosensores son biosensores basados ​​en ligandos de afinidad en los que una reacción inmunoquímica genera varios tipos de señales (ópticas, electroquímicas, termométricas o microgravimétricas) cuando se unen a un objetivo específico, lo que les permite detectar la presencia de patógenos seleccionados en bajas concentraciones21,22. Varios estudios han demostrado con éxito la aplicación de biosensores para detectar el SARS-CoV-2 en hisopos nasales23,24, saliva20 y muestras de condensado del aliento exhalado25, y han logrado resultados similares o mejores en comparación con la RT-qPCR. Sin embargo, ningún estudio revisado por pares ha utilizado biosensores para detectar el SARS-CoV-2 en el aire.

Aquí, presentamos un monitor de calidad del aire (pAQ) de patógenos que combina un ciclón PILS de pared húmeda de tipo lote de alto flujo personalizado con un nanocuerpo derivado de una llama levantado contra la proteína de pico del SARS-CoV-2 unida covalentemente a un micro- Biosensor de inmunoelectrodo (MIE) para la detección casi en tiempo real de SARS-CoV-2 en el aire con una resolución de tiempo de 5 minutos. La tecnología MIE se adaptó a partir de un biosensor electroquímico utilizado para detectar β-amiloide en el contexto de la enfermedad de Alzheimer26,27,28. Los aerosoles cargados de virus se toman muestras directamente del aire en un medio de recolección líquido en el ciclón húmedo y se transfieren a la unidad de biosensor MIE, que detecta e informa la presencia de virus en 30 s. El rendimiento del ciclón húmedo se comparó con otros PILS de bajo flujo disponibles comercialmente. El rendimiento y la sensibilidad del monitor pAQ se validaron en el laboratorio utilizando múltiples variantes inactivadas del virus SARS-CoV-2.

El monitor pAQ comprende un ciclón de vidrio de pared húmeda de tipo discontinuo (en adelante denominado ciclón húmedo) acoplado a una unidad de detección MIE que alberga una unidad automatizada de manipulación de líquidos y un conjunto de biosensor MIE (Fig. 1). El ciclón húmedo (Figura 1 complementaria) está conectado a una bomba de vacío de alto flujo (Fein Power Tools, PA, EE. UU.) para tomar muestras de aire a ~1000 (±10%) lpm. Antes del muestreo de aire, el ciclón se llena con un volumen predefinido (~15 ml) de solución salina tamponada con fosfato (PBS). La caída de presión aspira rápidamente aire ambiente a través de una entrada tangencial creando un vórtice, que produce una película giratoria de líquido PBS en la pared interna del ciclón29. Los aerosoles que ingresan al ciclón húmedo impactan las paredes internas mojadas y se recogen en el medio líquido. Los aerosoles no capturados por el ciclón húmedo salen por la parte superior y son capturados por un filtro absorbente de partículas de alta eficiencia (HEPA). Se toma una muestra del aire durante 5 minutos, después de lo cual la solución concentrada de aerosol + PBS se transfiere a la unidad de detección MIE.

un esquema del monitor pAQ que muestra el ciclón húmedo PILS acoplado con la unidad de detección MIE que comprende un biosensor MIE sumergido conectado a un potenciostato y accesorios automatizados de manipulación de líquidos, yb representación 3D del monitor pAQ propuesto.

La unidad de detección consta de un biosensor sumergido unido a un potenciostato, bombas peristálticas para manejar las operaciones de transferencia de líquido, una microcomputadora, depósitos de reactivos llenos de ácido hipocloroso (HOCl), PBS y una solución de albúmina sérica bovina (BSA) al 1% diluida en PBS para calibración de sensores. El biosensor utiliza electrodos de carbono serigrafiados para detectar la presencia de aerosoles de virus basándose en la técnica MIE desarrollada en el Laboratorio Cirrito26, 27. Para detectar los viriones del SARS-CoV-2, un nanocuerpo derivado de llamas se une covalentemente a la superficie del electrodo30. 31. Detecta la oxidación de los aminoácidos tirosina presentes en la proteína de pico del SARS-CoV-2 (consulte el Método complementario 2). Los SPCE se tratan previamente con PBS y la superficie se bloquea previamente en una solución de BSA al 1% para evitar la unión de especies electroactivas no específicas. El biosensor MIE está conectado a un potenciostato (PalmSens BV, Países Bajos) y se realiza voltamperometría de onda cuadrada (SWV) en soluciones en blanco y de muestra. El voltaje aplicado se incrementa gradualmente de 0 a 1 V a una frecuencia de 15 Hz. A ~0,65 V, la tirosina en la proteína de pico (S) del SARS-CoV-2 se oxida y el MIE la detecta como corriente de oxidación máxima. La magnitud de la corriente de oxidación máxima a ~0,65 V indica la concentración del virus en cada muestra de prueba (consulte el Método complementario 3).

La recuperación de partículas dependiente del tamaño dentro del ciclón húmedo utilizado en el monitor pAQ se calculó primero mediante simulaciones CFD (Figura complementaria 2). Los resultados del modelo CFD muestran que el ciclón húmedo tiene una eficiencia de recolección >95 % para partículas >1 μm y un diámetro de corte (donde la eficiencia de recolección es del 50 %) de 0,4 μm.

Posteriormente, el rendimiento del muestreo del virus del ciclón húmedo se comparó experimentalmente con dos PILS disponibles comercialmente: un BioSampler® (SKC Inc., EE. UU.)32 y un Liquid Spot Sampler™ (LSS; Aerosol Devices, EE. UU.)33. Los experimentos de intercomparación PILS se realizaron mediante la pulverización de la cepa Washington inactivada (WA-1) del virus SARS-CoV-2 dentro de una cámara de prueba de acero inoxidable sellada de 21 m3 bien mezclada (Figura complementaria 4). Los instrumentos se configuraron para tomar muestras del aire dentro de la cámara simultáneamente durante 10 minutos. Tenga en cuenta que, si bien el ciclón húmedo de alto flujo requiere <5 minutos de muestreo para la detección de virus, realizamos los experimentos en cámara durante 10 minutos para garantizar que se recolectara una concentración de virus suficiente en BioSampler® y LSS para el análisis de RT-qPCR. Después del muestreo, el virus recolectado en cada dispositivo se cuantificó mediante RT-qPCR. Para estudiar la influencia de la concentración inicial de virus en el rendimiento del muestreo, realizamos experimentos en cámara en tres condiciones de carga de virus: <500 copias/m3 (“baja”), 500–10 000 copias/m3 (“media”) y >10 000 copias. /m3 (“alto”). Todos los experimentos se realizaron por duplicado o triplicado. En el Método complementario 5 se proporciona una descripción detallada de la configuración y el protocolo experimentales.

La Figura 2a compara la recuperación de virus del ciclón húmedo con BioSampler® y LSS dentro de una cámara sellada en concentraciones de WA-1 en aerosol bajas, medias y altas. Después de 10 minutos de muestreo, la concentración de ARN viral medida por el ciclón húmedo (es decir, copias de ARN/mL de medio de recolección) fue, en promedio, ~10 y ~50 veces mayor que la concentración medida en BioSampler® y LSS, respectivamente. . Curiosamente, en condiciones de baja concentración, el ARN WA-1 se recuperó solo en el ciclón húmedo, mientras que las muestras recolectadas dentro del BioSampler® y LSS eran demasiado bajas para ser cuantificadas mediante RT-qPCR. La alta recuperación de ARN por parte del ciclón húmedo se puede atribuir a su caudal extremadamente alto, que le permite tomar muestras de un mayor volumen de aire (~10 m3) durante la recolección de muestras de 10 minutos en comparación con el BioSampler® (~0,125 m3) y el LSS. (~0,015m3). Esta característica hace que el ciclón húmedo sea ideal para su uso en aplicaciones de monitoreo continuo de alta resolución en entornos del mundo real, como hospitales y salas de aislamiento de pacientes, donde las concentraciones de ARN del SARS-CoV-2 en el aire podrían variar de 2 a 94 000 copias/m3 ( Figura 2b)9,34,35,36,37,38,39. En condiciones WA-1 medias y altas, la concentración de ARN normalizada del volumen de aire medida por el ciclón húmedo fue menor que la concentración informada por el BioSampler®, pero fue mayor o similar a las concentraciones determinadas por el LSS. Estos resultados son consistentes con los hallazgos de Raynor et al. 14, donde probaron el rendimiento de ocho muestreadores de aire para recolectar virus de la influenza y concluyeron que los muestreadores de alto caudal (>200 lpm) tenían la mayor recuperación de virus y eran ideales para la detección de virus en un ambiente con bajas concentraciones de virus. Sin embargo, los muestreadores de bajo caudal (p. ej., BioSampler®) proporcionan una estimación más precisa de la concentración de virus en el aire. Luhung et al.40 también informaron un hallazgo similar, donde investigaron el efecto del aumento del caudal del muestreador de bioaerosol (100 lpm a 300 lpm) en la recuperación de bioaerosol y concluyeron que el muestreo de aire de alto flujo maximizaba la resolución temporal y mejoraba tasa de captura de virus, especialmente en concentraciones de bioaerosol ultrabajas. Sin embargo, el muestreo de alto flujo es susceptible a una estimación inexacta de la concentración de bioaerosol por unidad de volumen de aire. La subestimación de la concentración de ARN del virus por parte del ciclón húmedo en el estudio de la cámara podría deberse a pérdidas por evaporación, pérdida de partículas en las paredes de la cámara, pérdida por rearrastre o rebote de partículas comúnmente observado en el muestreo de ciclones húmedos de alto flujo41,42.

a Experimentos de cámara que comparan el rendimiento del ciclón húmedo con BioSampler® y LSS para tres niveles de concentración de virus en aerosol: <500 copias/m3 (bajo; n = 3), 500–10 000 copias/m3 (medio; n = 2) y > 10.000 copias/m3 (alta; n = 4). Los datos se presentan como media ± 1 DE de 'n' experimentos independientes (b) concentración típica de copias de ARN del SARS-CoV-2 medidas en el aire interior; las líneas de puntos verticales delimitan los niveles de prueba de concentración de virus baja, media y alta; c Valor Ct de PCR (eje y invertido) de muestras de aire interior recolectadas utilizando el ciclón húmedo en apartamentos con pacientes positivos para SARS-CoV-2 (n = 7) y sala de control (n = 3). Los datos se presentan como media ± 1 DE de 'n' muestras independientes.

Enviamos el conjunto del monitor pAQ a los apartamentos de dos pacientes con SARS-CoV-2 positivo para tomar muestras del aire interior (Método complementario 6). Las siete muestras de aire recolectadas con el ciclón húmedo en los dos apartamentos ocupados por pacientes con SARS-CoV-2 dieron positivo según RT-qPCR (Fig. 2c). Los resultados de RT-qPCR de muestras de dormitorios se compararon con muestras de aire recolectadas en una sala de control libre de virus. Los valores de Ct de las muestras de aire de los hogares infectados oscilaron entre 32,7 y 34,9. Por el contrario, no se detectó ARN del SARS-CoV-2 en las muestras de aire de control. Los valores de Ct significativamente más bajos observados en las muestras de aire del apartamento en comparación con el aire de control indican la presencia de ARN del SARS-CoV-2 en el aire del apartamento. Tenga en cuenta que el alto valor de Ct (32,7–34,9) medido sugiere que las muestras recolectadas fueron débilmente positivas para el SARS-CoV-2 y tenían una concentración de ARN muy baja (consulte el Método complementario 8), lo que sugiere una baja eliminación de aerosoles del virus por parte de ambos voluntarios, que auto-autoevaluados. reportados como asintomáticos durante el período de muestreo. Estos resultados son consistentes con otros estudios que también han reportado una presencia baja pero estadísticamente significativa de SARS-CoV-2 en salas de aislamiento de pacientes con COVID y resaltan la importancia de controlar la transmisión aérea del virus5, 11.

La Figura 3a muestra el LoD específico de la variante del SARS-CoV-2 del monitor pAQ calculado para un muestreo de aire de 5 minutos. El monitor de pAQ tiene un LoD de 35, 7, 9 y 23 copias de ARN/m3 de aire para las cepas WA-1, delta, beta y BA-1, respectivamente. La variabilidad en el LoD se debe a las mutaciones específicas de la variante del SARS-CoV-2 en el epítopo del dominio de unión del receptor de proteína de pico que se une al nanocuerpo, lo que probablemente varía la eficiencia de unión del nanocuerpo y, por lo tanto, altera la intensidad de la señal del biosensor. Sin embargo, como se desprende de la Fig. 3a y la Fig. 3 complementaria, la intensidad de la señal del biosensor MIE utilizado en el monitor pAQ es suficiente para detectar concentraciones ambientalmente relevantes de las cuatro variantes del SARS-CoV-2 probadas, lo que subraya su uso como indicador ambiental. Dispositivo de vigilancia del SARS-CoV-2. Tenga en cuenta que estos valores solo se aplican a aerosoles de virus >1 μm (~ 100 % de eficiencia de recolección). El LoD para el virus en los aerosoles de tamaño submicrónico variará según la fracción de recuperación dependiente del tamaño de las partículas del ciclón húmedo (Figura complementaria 2). La figura 3b muestra el rendimiento del monitor de pAQ cuando se toman muestras de WA-1 y BA-1 inactivados en aerosol en el laboratorio. El monitor pAQ mostró una sensibilidad del 77% para WA-1 y del 83,3% para BA-1. Las concentraciones de muestras de aerosol WA-1 medidas mediante RT-qPCR se proporcionan en la figura complementaria 7. La sensibilidad al virus del pAQ es comparable a la sensibilidad de otros biosensores rápidos desarrollados recientemente (tiempo de detección <10 min) utilizados para detectar virus en muestras de saliva43,44, hisopos nasales45 y condensado de aliento exhalado25.

un LoD específico de la variante del SARS-CoV-2. Los datos se presentan como media ± 2 DE de n = 3 muestras independientes, b Datos de diagrama de caja de prueba de concepto que muestran la corriente de oxidación del monitor de pAQ mientras se toma el muestreo de WA-1 inactivado en aerosol (Washington, n = 13) y BA-1 (Omicron, norte = 6). El cuadro contiene entre el percentil 25 y el 75 de las mediciones, la línea central del cuadro indica la media y los bigotes indican la corriente de oxidación mínima y máxima medida en 'n' experimentos independientes.

Este estudio demuestra una prueba de concepto de monitor pAQ construido acoplando un PILS basado en un ciclón húmedo con un biosensor MIE ultrasensible. Los experimentos en cámara y el muestreo de aire interior de los apartamentos de dos pacientes positivos para SARS-CoV-2 demuestran la alta eficiencia de captura de virus del ciclón húmedo incluso en entornos con baja concentración de virus. La alta sensibilidad (77–83%), la alta resolución temporal (5 min), el bajo LoD (7-35 copias de ARN/m3) y la capacidad de automatización del monitor pAQ lo convierten en una opción ideal a un precio asequible (consulte la Discusión complementaria 1). Detección en tiempo real de virus en diferentes entornos interiores, como escuelas, residencias, oficinas, salas de conferencias y lugares públicos concurridos, donde el monitoreo de virus en tiempo real (muestreo longitudinal o aleatorio) permitiría a los ocupantes tomar medidas inmediatas para prevenir o limitar. la transmisión aérea del SARS-CoV-2.

Una limitación del monitor pAQ propuesto es el alto nivel de ruido (75–80 dB) durante el funcionamiento del dispositivo, que puede tener un efecto adverso en la salud y el confort de los ocupantes de un edificio. Actualmente se están realizando esfuerzos para encontrar soluciones económicamente viables para reducir los niveles de ruido a <65 dB, como el uso de un motor silencioso y la insonorización del exterior del dispositivo mediante un revestimiento acústico. Además, estamos trabajando para detectar simultáneamente otros patógenos transmitidos por el aire utilizando el monitor pAQ mediante la multiplexación de biosensores MIE con diferentes nanocuerpos específicos. Si bien los hallazgos de este estudio demuestran la idoneidad del monitor pAQ para aplicaciones del mundo real, el sistema aún requiere más pruebas para verificar la solidez de los resultados en diversos entornos con diferentes composiciones de aerosoles. El trabajo futuro se centrará en investigar exhaustivamente posibles agentes de interferencia en el aire que podrían influir en el rendimiento del biosensor.

Antes de cualquier medición de muestra, la lectura inicial del biosensor se adquiere transfiriendo 2 ml de solución de calibración (es decir, 1 % de BSA en PBS) al vial de MIE y realizando voltamperometría de onda cuadrada (SWV). Luego se transfieren 2 ml de la muestra de aerosol de prueba al vial de MIE y se realiza una SWV para medir la altura del pico de oxidación correspondiente a la tirosina oxidada en la partícula viral. La oxidación de la tirosina se produce a ~0,65 V. El nanocuerpo derivado de la llama proporciona especificidad contra la proteína de pico del SARS-CoV-2. La altura del pico de oxidación de tirosina medida para cada muestra de prueba de aerosol se normaliza con la altura del pico de oxidación obtenida para el control del aire libre de virus para clasificar la señal como lectura positiva o negativa. Después de 10 ciclos de muestreo, se inyectan ~15 ml de HOCl en el ciclón para su descontaminación. Mientras el MIE analiza una muestra, el ciclón húmedo comienza a recolectar la siguiente muestra en paralelo. Los métodos complementarios 2 y 3 proporcionan una descripción de la preparación del biosensor y el flujo de trabajo paso a paso del monitor pAQ. En la Fig. 1b se muestra una representación 3D del monitor pAQ propuesto realizada con el paquete de software SolidWorks (Dassault Systèmes, Vélizy-Villacoublay, Francia).

El rendimiento del ciclón húmedo se evaluó numéricamente utilizando el software de dinámica de fluidos computacional (CFD) (Ansys Fluent 2021 R1). El seguimiento de partículas de tamaño específico dentro del ciclón se realizó utilizando el método de fase discreta Fluent. El flujo de fluido dentro del ciclón se simuló utilizando el modelo de tensión de Reynold46. Los supuestos y las condiciones de contorno utilizados en la simulación se proporcionan en el Método complementario 1.

El conjunto del ciclón húmedo (el ciclón, la bomba de vacío y la solución de PBS) se envió a los apartamentos de dos voluntarios que dieron positivo al SARS-CoV-2. Los voluntarios recolectaron muestras de aire de 5 minutos (n = 3 a 4) del interior de sus dormitorios/apartamentos y luego las almacenaron en tubos de centrífuga de 15 ml en hielo. Luego, las muestras líquidas se transportaron a un laboratorio y se analizaron mediante RT-qPCR para detectar la presencia de SARS-CoV-2. Se proporcionan más detalles sobre el procedimiento de muestreo en el Método complementario 6.

El límite de detección (LoD) del monitor de pAQ se calcula mediante la ecuación. (1):

El LoD del biosensor MIE se calculó mediante dilución secuencial de una solución madre pura del virus inactivado. Se diluyó secuencialmente una alícuota inicial del virus de concentración conocida y se midió la corriente de oxidación (Iox) en función del SWV. Las concentraciones virales más bajas detectadas por el biosensor fueron 32, 8, 6 y 21 copias de ARN/mL para USA/WAa1/2020 (WA1), Beta (B.1.351), Delta (B.1.617.2) y Omicron ( BA.1) cepas de SARS-CoV-2, respectivamente (Figura complementaria 3). El volumen de líquido dentro del ciclón después de un muestreo de 5 minutos cae (55-65%) debido a la evaporación durante el muestreo. Para el cálculo del LoD, tomamos el volumen restante dentro del ciclón húmedo como el promedio de 10 experimentos de muestreo replicados de 5 minutos.

El cálculo de la sensibilidad del monitor de pAQ, que incorpora los errores de la recolección de muestras del ciclón húmedo y el paso de detección del biosensor, se determinó nebulizando WA-1 y BA-1 inactivados (cepa Omicron) usando un nebulizador Collison y tomando muestras durante 5 minutos usando el ciclón húmedo. (Método complementario 7). Luego, las muestras recolectadas se dividieron manualmente en dos porciones, una se analizó utilizando el biosensor y la otra se analizó con RT-qPCR. Debido a problemas logísticos, no se realizó RT-qPCR en las muestras BA-1. Utilizamos el paquete de software Origin Pro 2022 para realizar estadísticas descriptivas básicas y generar las Fig. 2 y Fig. 3.

Las copias de ARN viral del SARS-CoV-2 en muestras en aerosol se cuantificaron mediante RT-qPCR según el método descrito en Darling et al.47. El ARN se extrajo de muestras de 140 µl utilizando el kit QIAamp Viral RNA Mini (Qiagen) y se eluyó con 60 µl de tampón AVE. Se utilizaron 8,5 μl de ARN para RT-qPCR en tiempo real para detectar y cuantificar el gen N del SARS-CoV-2 utilizando el kit de 1 paso TaqMan™ RNA-to-CT (Thermo Fisher Scientific) en un QuantStudio 12 K Flex Real-time Termociclador (Applied Biosystems) utilizando el programa de ciclo térmico predeterminado. Los cebadores y sondas utilizados fueron el kit 2019-nCoV RUO (IDT). El ARN viral se expresó como números de copias del gen N por ml, según un estándar incluido en el ensayo, que se creó mediante la transcripción in vitro de una molécula de ADN sintético que contiene la región objetivo del gen N. Las curvas de disociación se analizaron después del ensayo de qPCR para confirmar la eficacia del cebador. Los niveles relativos de ARNm se calcularon mediante el método Ct comparativo utilizando el paquete de software ABI 12 K Flex versión 1.3. La conversión de los valores de Ct al volumen de concentración normalizada del aire muestreado se proporciona en el Método complementario 8.

La Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Washington consideró innecesaria la aprobación de este proyecto porque (1) el estudio no recopiló información sobre un ser humano vivo, (2) el estudio no implicó una interacción o intervención con un ser humano vivo realizada con fines de investigación, ( 3) el estudio no implicó la recopilación o el uso de información privada identificable, y (4) el estudio no estaba probando un dispositivo diseñado para diagnosticar o tratar una condición médica. Se obtuvo el consentimiento informado de los dos voluntarios para recolectar y analizar muestras de aire interior de sus apartamentos.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos de origen se proporcionan como un archivo de "Datos de origen". Los datos originales se proporcionan con este documento.

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Este trabajo fue financiado por el programa RADx-Rad de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) bajo U01 AA029331 y U01 AA029331-S1 (JRC, RKC y CMY), NIH, Programa de investigación intramural del Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares (NINDS). la Universidad de Ciencias de la Salud de Servicios Uniformados (DLB); Programa de evaluación de la evolución viral (SAVE) del NIH SARS-CoV-2 (ACMB) y programa de maestría conjunto WashU-IITB (JVP y AGM). Y2X Life Sciences tiene una opción exclusiva para licenciar esta tecnología para su comercialización y fue consultado durante la etapa de diseño. El biosensor utilizado en este estudio aún se encuentra en etapa de investigación. Los autores correspondientes pueden proporcionar el protocolo para construir y operar el biosensor para grupos académicos no comerciales interesados ​​previa presentación de una solicitud por escrito, para uso de investigación académica no comercial. Las opiniones expresadas en esta presentación son las de los autores y no reflejan la política o posición oficial de la Universidad de Servicios Uniformados, el Ejército de los EE. UU., el Departamento de Defensa o el Gobierno de los EE. UU.

Nishit J. Shetty

Dirección actual: Ingeniería Civil y Ambiental, Virginia Tech, Blacksburg, VA, 24061, EE. UU.

Centro de Ciencia e Ingeniería de Aerosoles, Departamento de Energía, Ingeniería Química y Ambiental, Universidad de Washington en St. Louis, St. Louis, MO, 63130, EE. UU.

Joseph V. Puthussery, Dishit P. Ghumra, Benjamin J. Sumlin, Amirhossein Sarabandi, Anushka Garg Mandal, Nishit J. Shetty y Rajan K. Chakrabarty

Departamento de Neurología, Centro Hope para Enfermedades Neurológicas, Centro de Investigación de la Enfermedad de Alzheimer Knight, Universidad de Washington, St. Louis, MO, 63110, EE. UU.

Kevin R. McBrearty, Brookelyn M. Doherty, Woodrow D. Gardiner, Jordan P. Magrecki y John R. Cirrito

Departamento de Ingeniería Química, Instituto Indio de Tecnología de Bombay, Mumbai, 400076, India

Anushka Garg Mandal

Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares, Bethesda, MD, EE. UU.

David L. Brody y Thomas J. Esparza

Departamento de Neurología, Universidad de Ciencias de la Salud de Servicios Uniformados, Bethesda, MD, EE. UU.

David L. Brody

Departamento de Medicina, Universidad de Washington, St. Louis, MO, 63110, EE. UU.

Traci L. Bricker y Adrianus CM Boon

Departamentos de Microbiología Molecular y Patología e Inmunología, Facultad de Medicina de la Universidad de Washington, St. Louis, MO, EE. UU.

Adrianus CM Boon

Departamento de Psiquiatría, Facultad de Medicina de la Universidad de Washington, St. Louis, MO, 63110, EE. UU.

Carla M. Yuede

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Investigación conceptualizada por JRC, RKC, CMY, JVP, BJS; JVP, DPG, KRM, WDG, BMD, JPM, AS, AGM realizaron investigaciones y análisis de datos. DLB, TJE, TLB y ACMB brindaron experiencia y orientación durante el diseño del experimento y la adquisición de muestras. JVP, DPG y RKC escribieron el artículo con aportaciones de JRC, CMY, BJS y NJS.

Correspondencia a Carla M. Yuede, John R. Cirrito o Rajan K. Chakrabarty.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Un archivo de revisión por pares está disponible.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Reimpresiones y permisos

Puthussery, JV, Ghumra, DP, McBrearty, KR et al. Vigilancia ambiental en tiempo real de aerosoles de SARS-CoV-2. Nat Comuna 14, 3692 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-39419-z

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Recibido: 28 de febrero de 2023

Aceptado: 12 de junio de 2023

Publicado: 10 de julio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-39419-z

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